HIV/艾滋病基因治疗进展(三):基于基因编辑技术的基因疗法

目前，基于基因编辑技术（如锌指核酸内切酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9等）的HIV/艾滋病基因治疗已进行了大量临床前和临床试验，利用此技术对病毒感染和复制相关基因进行改造或干预，希望能够减缓疾病进程，最终实现HIV/AIDS的功能性治愈或彻底治愈。

初期的研究结果从侧面表明基因编辑技术用于HIV/艾滋病治疗的巨大潜力。例如：2009年报道的一位患者通过骨髓移植，成功治愈艾滋病。由于骨髓捐献者的CCR5基因编码区域发生突变，使CCR5作为HIV辅助受体的能力受损，最终导致CCR5基因突变的细胞具HIV感染抗性。但由于骨髓配型成功率低，再加上有CCR5相应突变的人很少，因此，上述治疗方案只能用于极个别的幸运患者。但是，此案例使研究人员更加相信通过基因编辑技术改造与HIV感染或复制相关基因（如CCR5、CXCR4、LEDGF等）可以治疗艾滋病。尽管目前存在诸多技术难题，安全性及有效性有待进一步验证，但其临床应用潜力巨大。

1. CCR5基因

首个人工改造的CCR5是经ZFN基因编辑技术实现的，在人多能干细胞（hiPSCs）及人胚胎干细胞（hESCs）中表明了此技术治疗艾滋病的可能性。人源化小鼠体内实验表明：经基因编辑技术敲除CCR5基因的造血干/祖细胞（HSPCs）回输后，小鼠可以抵抗HIV感染。另外，一例Ⅰ期临床试验表明：ZFN介导的CCR5编辑技术安全有效，此研究中12位持续HIV病毒血症患者接受了单次剂量的经ZFN改造的自体CD⁴⁺ T 细胞，大多数患者血液HIV DNA与 RNA水平降低，其中一位患者的血液RNA水平降至检测限以下。此外，患者的免疫功能也获得重建，CD⁴⁺ T细胞数量明显升高。当然，还有一些基于ZFN技术编辑CCR5的艾滋病治疗方案处于或将要进行临床Ⅰ期试验。此外，基于TALEN 或 CRISPR/Cas9的CCR5基因编辑研究也取得了一定进展。

2. CXCR4基因

基因编辑技术对CCR5基因的改造达到了良好的HIV/艾滋病治疗效果，启发了科学家利用基因编辑技术对CXCR4基因进行改造。CXCR4是HIV感染细胞的另外一种辅助受体。尽管进行了体外细胞实验及部分动物实验，疗效明显。但是考虑到CXCR4广泛分布在多种细胞表面，参与多种重要的生理功能，因此，基于CXCR4基因突变与敲除的艾滋病临床治疗试验需慎之又慎，必须进行足够大量的临床前评估。或许，未来研究人员能够找到一种更为安全的策略，在不影响正常生理功能的条件下，突变或敲除CXCR4基因来抗HIV感染。

3. HIV前病毒

基因编辑技术清除HIV前病毒是另一种基于基因编辑技术的HIV/艾滋病治疗的新策略。

抗病毒鸡尾酒疗法（即高效抗逆转录病毒治疗，HAART）虽能够有效控制HIV的复制，但是难以对付潜伏在细胞内的前病毒。一旦停止鸡尾酒疗法，潜伏的前病毒活化后产生大量游离病毒，因此，艾滋病患者必须终身服药。清除患者体内的潜伏前病毒是HIV/艾滋病领域最棘手的问题。近些年，基因编辑技术的发展让人们看到了解决这一难题的曙光。

前期研究表明CRISPR/Cas9技术在体外细胞实验上能够将潜伏在细胞内的HIV前病毒清除，并证明此技术对细胞无毒副作用且无脱靶效应，能精确的切割HIV-1前病毒的5′到3′LTR 9709 bp前病毒基因组。这一研究提供了清除患者体内潜伏HIV-1前病毒的新策略。

然而，最大的挑战在于如何向体内感染的组织或细胞中导入CRISPR/Cas9系统。近几年备受关注的腺相关病毒（AAV）基因传递系统获得了极大的发展，以其低毒性与导入基因的持续表达时间长等特性而广泛应用于癌症、心脏病、神性系统疾病、关节炎、肌营养不良症和囊性纤维化等疾病。近期，研究人员利用AAV基因载体将saCas9/gRNA运送到有HIV-1前病毒整合的转基因小鼠与大鼠中，两周后，研究人员提取了试验动物不同器官组织中的DNA，分析结果显示实验动物各组织的HIV-1前病毒都被从其基因组中切除了。此研究成果具有重大的临床意义，在未来几年进一步优化此技术的基础上可能会开展部分临床试验。

此外，基于CRISPR/Cas9的技术，通过失活其核酸酶活性和设计靶向相应基因启动子的特异sgRNA基因，可以激活相应基因的特异性表达。近期，复旦大学Ji等人研究表明：基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的dCas9-SunTag-VP64，即将核酸酶活性部分替换为特异性的转录激活因子，可以在不活化T细胞及无细胞毒性的情况下，激活潜伏病毒的转录。此策略也许是活化潜伏HIV的有效手段，与非基因方法相比，基因治疗的优势与不足以及如何有效的将此基因药物导入病毒潜伏库所在的细胞组织是有待解决的问题。

另外，基于其它基因编辑技术（如：ZFN）切除HIV前病毒的研究也获得了一定的进展。

4. 其它靶点基因

除了基因编辑技术针对的上述治疗靶点外，还有很多其它的治疗靶标也处于试验研究中。如： HIV整合辅助因子LEDGF，宿主限制因子APOBEC3G, TRIM5a，抑制HIV env 表达的TSPO等。其整体策略是：对于利于HIV感染和复制的基因进行突变或敲除，抑制其活性或表达；对于抗HIV基因进行激活或进一步活化，促进其表达。（欢迎分享本文，转载请保留出处：微信公众号基因治疗领域）